PRINSIP DASAR  PEMBUATAN HEWAN TRANSGENIK 

PENDAHULUAN

            Berbagai penelitian untuk menyingkap fungsi suatu gen telah banyak dilakukan. Walaupun para ahli telah dapat menginsersikan fragmen DNA atau gen yang ingin dipelajari dengan metode transfeksi pada sel-sel tertentu yang dikultur di media kultur tertentu, tetapi mereka belum puas karena sering hasil yang diperoleh secara invitro berbeda dengan hasil yang diperoleh secara invivo. Para ahli ingin mempelajarinya langsung pada mahluk hidup yang utuh (invivo).  

Ada 2 cara untuk mempelajari fungsi gen tertentu secara langsung pada mahluk hidup yaitu dengan cara transgenik dan penginaktifan gen (gene disruption / gene knock out)1. Pada organisma transgenik, gen atau fragmen DNA yang dimasukkan bisa merupakan gen atau fragmen DNA yang memang terdapat didalam organisme tersebut (endogen) dengan tujuan untuk mendapatkan ekspresi yang lebih kuat (overekspresi gen) dan bisa pula gen atau fragmen DNA yang tidak terdapat pada organisma tersebut (eksogen). Pada tehnik gene disruption atau knock out gene, gen tertentu yang akan dipelajari yang terdapat di dalam organisma tersebut dibuat menjadi tidak aktif.

            Tikus transgenik telah banyak digunakan secara luas di dalam penelitian biomedik. Riwayat tikus transgenik dimulai ketika Palmitter pada tahun 1981 memasukan gen thymidine kinase dari virus herpes ke dalam sel telur tikus yang telah dibuahi (zygot).2,3 Beberapa makalah tentang tikus transgenik telah dipublikasikan oleh Palmitter (1986)4, Jaenisch (1988)5 dan Hanahan (1989)6. Gordon dkk pada tahun 1983 telah mengembangkan tehnik yang lebih baik dan fleksibel yaitu dengan menyuntikkan gen yang akan diamati secara langsung ke dalam pronucleus telur tikus yang telah dibuahi/ fertilized eggs (zigot)7. Metode untuk membuat tikus transgenik makin disempurnakan oleh Hogan dkk pada tahun 1994.8

Makalah ini akan membicarakan metoda yang terakhir dikembangkan oleh Hogan dkk untuk memasukkan fragmen DNA atau gene secara langsung ke dalam pronukleus zigot tikus dan cara untuk memproduksi tikus transgenik.

DEFINISI

Tikus transgenik  adalah tikus yang mempunyai genom (susunan gen) yang telah dimodifikasi secara artifisial melalui rekayasa genetik (genetic engineering) dan dapat diteruskan kepada turunannya.1,2

            Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel akan diligasikan secara ujung ke ujung (end to end) kesuatu tempat tertentu di dalam suatu kromosom secara acak oleh ensim ligasi intraselular sehingga gen atau fragmen DNA itu akan tersusun secara tandem2,9 (Gb-1).  Telur tikus yang telah dibuahi (fertilized eggs) atau zigot yang pronukleusnya disuntikkan fragmen DNA akan berkembang menjadi tikus dengan banyak sel-sel tubuhnya mengandung fragmen DNA atau gen yang dimasukkan tersebut. Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan ini akan menempel dan tersusun secara tandem pada tempat tertentu di dalam suatu kromosom individu transgenik (host) tersebut secara random.2,3 Bila kromosom yang telah dimodifikasi ini hadir pada sel-sel kelamin (sel telur dan sperma) maka tikus tersebut akan meneruskan kromosom yang telah dimodifikasi ini ke tikus turunannya. Tikus yang susunan gennya telah berubah secara permanen ini dikenal sebagai tikus transgenik (transgenic mice), sedangkan gen yang dimasukkan tersebut disebut sebagai transgen.3

 KEGUNAAN TIKUS TRANSGENIK

Tikus transgenik digunakan sebagai model hewan coba untuk mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh dan gen-gen yang spesifik yang berperan dalam pertumbuhan jaringan tubuh tertentu serta mempelajari fenotif gen pada jaringan tubuh. Disamping itu tikus transgenik juga dapat digunakan untuk mempelajari regulasi gen-gen yang berperan dalam proses terjadinya kanker (oncogenesis) dan mempelajari efek zat atau senyawa tertentu dalam terapi penyakit.2,3,10

PROSES  PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIK

Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan waktu yang lama.

2017-01-20 18_52_54-Transgenic Mice- Biomedik 26 Oktober 2015 [Compatibility Mode] - Microsoft Word.png

PERSIAPAN PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIKAda 2 metoda untuk membuat tikus transgenik yaitu19,20: (1) Pronuclear microinjection yaitu transgen dimasukkan secara langsung kedalam pronukleus telur tikus yang sudah difertilisasi (fertilized egg/zygote), (2) Embryonic Stem (ES) cell electroporation and subsequent blastocyst injection yaitu insersi transgen kedalam sel induk embrionik (embryonic stem cells/ES cells) yang dilanjutkan dengan pemasukkan ES cells kedalam blastokista. Makalah ini akan menguraikan cara membuat tikus transgenik dengan metoda pronuclear microinjection.

            Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum membuat tikus transgenik serangkaian perisapan yang harus dilakukan adalah (1) persiapan gen (transgen) yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus telur tikus yang telah dibuahi (zigot), (2) persiapan tikus yang akan digunakan, (3) persiapan alat dan bahan, (4) persiapan sistem deteksi ada tidaknya transgen dalam susunan genom ”calon” tikus transgenik (tikus yang berkembang dari zigot yang disuntikkan transgen).

  1. Persiapan Transgen

            Fragmen DNA atau gen yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus zigot harus mengandung promoter, complete protein coding region, sedikitnya satu intron dan polyadenylation site.11

Transgen ini didapatkan dan di amplifikasi dari suatu genom organisme tertentu dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Produk PCR kemudian ditanam pada daerah kloning (cloning site) vector plasmid dengan menggunakan ensim ligase. Vector yang mengandung transgen ini kemudian ditransfeksikan kedalam bakteri tertentu dengan tehnik heat shock. Bakteri kemudian ditanam dan ditumbuhkan pada media agar (agar plate). Setelah tumbuh, bakteri kemudian diperbanyak (dibiakkan) pada media agar yang cair. Plasmid yang mengandung transgen kemudian diisolasi dari bakteri yang telah dilisiskan dengan tehnik tertentu. Fragmen transgen ini kemudian diisolasi dari plasmid dengan menggunakan ensim restriksi (restriction enzyme) dikuti dengan pemisahan dan pemurnian pada gel agarosa dan dilanjutkan dengan isolasi fragmen DNA dari gel agarosa (Gb-2).

            Walaupun sekuens (fragmen DNA) dari vector prokariotik tampaknya tidak mengganggu integrasi transgen pada hostnya tetapi sekuens tersebut dapat menghambat ekspresi dari transgen tersebut.10,12 Karenanya konstruksi gen yang akan ditransfer (transgen) tersebut harus dipurifikasi dahulu sebelum diinsersikan ke dalam pronukleus zigot untuk menghindari hal tersebut. Tak diketahui apakah hambatan ekspresi transgen ini akibat adanya susunan nukleotida tertentu dalam sekuens vector prokariotik tersebut atau merupakan sifat umum dari sekuens DNA vektor prokariotik tersebut.10,12

Panjang DNA pada transgen tidak dibatasi, bisa dari beberapa kilo base pair (Kbp) hingga 1000 kb (Lamb et 1999)13. Hal yang harus dipertimbangkan adalah vector yang digunakan dan cara konstruksinya.

Transgen yang dimasukkan kedalam host dapat satu macam atau lebih dari satu macam yang dicampur dalam satu pelarut dan disuntikkan secara bersamaan. Bila lebih dari satu transgen yang diinsersikan konsentrasi dari masing-masing transgen harus sama.

Bila gen yang diinsersikan merupakan gen yang memang sudah ada pada tikus (endogenous transgene), untuk membedakan produk dari transgen tersebut dengan RNA atau protein dari gen endogennya dapat dilakukan penyisipan oligonucleotida pada daerah yang tidak ditranslasikan (untranslated region)14,15 atau menginsersikan gen kecil yang mengkode RNA yang pendek pada transgen tersebut16.  Akan tetapi harus diingat adanya protein kecil yang ”mendompleng” pada protein yang dikode oleh transgen tersebut mungkin berpengaruh terhadap fungsi protein yang dikode oleh transgen. Fusi dari sebuah epitope/peptida yang pendek dengan protein dari transgen dapat mempermudah pengenalan adanya protein yang dikode oleh transgen pada tikus host tersebut dengan menggunakan epitope-specific antibodi, atau fusi antara protein yang dikode oleh transgen dengan protein ”green fluorescent Protein (GFP)” yang dikode oleh gen reporter alkaline phosphatase akan mempermudah pendeteksian adanya ekspresi transgen pada tikus host tersebut17.

2017-01-20 18_53_49-Transgenic Mice- Biomedik 26 Oktober 2015 [Compatibility Mode] - Microsoft Word.png

Bentuk DNA Efisiensi dari trangen yang ditransfer dipengaruhi oleh beberapa faktor8 yaitu

Bentuk linier dari DNA transgen akan meningkatkan efisiensi integrasi transgen tersebut pada genom tikus hostnya

konsentrasi DNA

Konsentrasi DNA yang rendah akan menurunkan efisiensi pengintegrasian transgen. Sebaliknya konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat toksik bagi zigot. Konsentrasi DNA yang dianjurkan adalah 1.5-2 nanogram/mikroliter

kemurnian DNA

DNA yang diinseriskan harus bebas dari semua kontaminasi termasuk sisa phenol, etanol atau ensim)

buffer DNA

Buffer yang dipakai untuk melartkan DNA juga berperan dalam meningkatkan efisiensi pengintegrasian transgen pada hostnya. Pelarut yang sering dipakai adalah TE buffer yang mengandung 1mM EDTA.

  1. Persiapan tikus yang akan dipakai

Tikus yang akan dipakai untuk membuat tikus transgenik dikelompokkan menjadi 4 kelompok

  1. Kelompok tikus betina yang dibuat superovulasi (superovulated female mice)

Tikus betina yang termasuk kelompok ini dibuat menjadi superovulasi untuk mendapatkan telur yang dibuahi (zigot) dalam jumlah banyak. Untuk membuat superovulated female mice, tikus betina disuntik dengan Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG) yang mempunyai efek yang serupa dengan hormone FSH untuk menstimulasi perkembangan dan pematangan telur tikus dalam jumlah banyak. Dua hari setelah penyuntikan PMSG tikus ini disuntik dengan Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) untuk menstimulasi ovulasi.  Baik hormon PMSG maupun HCG disuntikan secara intraperitoneal. Tikus yang dipakai adalah yang sudah dewasa dengan umur 4-8 minggu tergantung pada strain yang dipakai. Tikus ini kemudian dikawinkan dengan tikus jantan kelompok fertile stud male mice dan diperiksa ada tidaknya plug kopulasi (copulation plug) besok paginya.

  1. Kelompok tikus jantan pengawin (fertile stud male mice)

Tikus ini dipakai untuk mengawini tikus betina untuk mendapatkan zigot. Tikus yang dipakai berumur 6-8 minggu dan mempunyai penampilan reproduksi yang baik.  Setelah dipakai mengawini superovulated female mice tikus jantan ini diistirahatkan beberapa hari.

  1. Kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu (pseudopregnant female mice)

Kelompok ini adalah tikus betina yang akan menerima zigot yang telah diinsersikan transgen kedalam pronukleusnya. Tikus ini dikawinkan dengan tikus dari kelompok sterile male mice dan dicek ada tidaknya plug kopulasi (copulation plug) besok paginya. Tikus yang dipakai berumur 6-8 minggu dengan berat badan antara 25-35 gram. Untuk mempermudah transfer zigot disarankan untuk menggunakan tikus yang mempunyai infundibulum yang besar agar mempermudah proses transfer, misalnya strain ICR.

  1. Kelompok tikus jantan yang disteril (sterile male mice)

Kelompok ini adalah kelompok tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara vasektomi (Gb-3). Tikus ini akan dikawinkan dengan tikus betina pseudopregnant female mice. Tikus yang dipakai berumur sediktinya 2 bulan. Sebelum dipakai sebaiknya tikus ini dicek ke ”steril” annya.

Gambar-3 Vasektomi pada tikus kelompok sterile stud male mice

  1. Persiapan alat dan bahan

Peralatan dan bahan yang harus dipersiapkan untuk membuat tikus transgenik meliputi

  1. Alat dan bahan untuk mengumpulkan telur tikus yang dibuahi (zigot)
    1. Spuit disposible
    2. Hormon Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG)
    3. Hormon Human Chorionic Gonadotrophin (HCG)

Gambar-4 Mouth controlled pipette

    1. Larutan kultur yaitu larutan D-PBS atau larutan lainnya yang ditambahkan bovine serum albumin (BSA), asam piruvat dan antibiotik (penisilin dan streptomisin)
    2. Larutan kultur yang mengandung ensim hyaluronidase
    3. Inkubator  (temperatur 37C, dengan kelembaban 95% dan mengandung 5% CO2)
    4. Surgical set termasuk watchmaker’s forceps
    5. Alkohol 70%
    6. Stereomikroskop
    7. Mouth controlled pipette (Gb-4)
    8. 35 mm petri dish
  1. Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot
    1. Holding pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk “memegang” zigot selama proses penyuntikan transgen ke dalam pronukleus zigot. Untuk ini diperlukan Borosilicate glass capilary dan mechanical pipette puller
    2. Injection pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk memasukkan transgen kedalam pronukleus zigot. Untuk ini diperlukan glass capillary tubing dengan internal glass filament dan mechanical pipette puller.

Gambar-5 Holding dan injection pipette

    1. Mikroskop yang mempunyai mikromanipulator.
    2. Paraffin oil
    3. Petri dish injection chamber
    4. Transgen yang dilarutkan dalam buffer TAE
  1. Alat dan bahan untuk identifikasi ada tidaknya transgen pada tikus host

Analisa ada tidaknya transgen di dalam ”calon” tikus transgenik (tikus yang berkembang dari zigot yang diinsersikan transgen) dapat dilakukan menggunakan Southern blot, Northern blot dan Western Blot.

TAHAPAN (PROSEDUR) PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIK

            Pembuatan tikus transgenik memerlukan  banyak tahapan dan proses yang panjang. Adapun tahap-tahap kegiatan terdiri atas

  1. Penyuntikan hormone PMSG intraperitoneal pada tikus superovulated female mice, dilanjutkan dengan penyuntikan hormon HCG 48 jam kemudian. Setelah disuntik HCG superovulated female mice dikawinkan dengan fertile stud male mice dan diperiksa ada tidaknya plug kopulasi keesokan harinya. Pada saat yang bersamaan tikus pseudopregnant mice dikawinkan dengan sterile stud male mice dan diperiksa ada tidaknya pulg kopulasi keesokan harinya. Tikus dengan plug positif dipisahkan dari tikus dengan plug negatif.
Gambar-6. Cara memegang tikus (kiri) dan cara penyuntikan hormon intraperitoneal (kanan)
  1. Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif.

Superovulated female mice dengan plug positif dimatikan dengan cara cervical dislocation (Gb-7). Setelah disemprot dengan alkohol 70% rongga perut dibuka dan saluran telur (oviduct) diangkat (Gb-8) dan diletakkan dalam medium kultur. Telur tikus yang telah dibuahi (zigot) diisolasi dari saluran telur (oviduct) dengan cara merobek saluran telur tersebut di bawah mikroskop. Saluran telur yang banyak mengandung zigot akan tampak menggelembung (Gb-9). Zigot yang telah dibebaskan dari saluran telur kemudian

Gambar-7 Cervical dislocation

 
Gambar-8 Isolasi saluran telur (oviduct) pada superovulated female mice

diletakkan dalam medium kultur yang mengandung ensim hyaluronidase di dalam 35mm petri dish selama beberapa menit (1-2 menit). Ensim hyaluronidase ini berfungsi untuk menghilangkan sel-sel kumulus yang menempel pada permukaan zigot. Setelah dicuci dalam media kultur yang tidak mengandung hyaluronidase telur-telur tikus yang telah dibuahi (zigot) (Gb-10) dikumpulkan dalam 35mm petri dish yang mengandung media kultur dan diinkubasi dalam inkubator 37C dengan kelembaban 95% dan mengandung 5% CO2.

  1. Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot)

Sebelum dilakukan penyuntikan transgen kedalam zigot, holding pipette diisi terlebih dahulu dengan mineral oil dan dipasang pada tempatnya pada micromanipulator. Injection pipette diisi dengan larutan yang mengandung transgen dengan menggunakan daya isap kapiler. Injection pipette dipasang pada tempatnya pada micromanipulator (Gb-11). Petri dish injection chamber diisi dengan sedikit media kultur dan ditutup dengan paraffin oil (Gb-12).

Gambar-9  Pembebasan zigot dari saluran telur (oviduct)

 

Gambar-10 Telur tikus di dalam media kultur pada 35mm petri dish

Telur tikus yang dibuahi (zigot) ditransfer dari 35mm petri dish ke petri dish injection chamber dengan menggunakan mouth controlled pipette. Zigot yang ditransfer haruslah normal yang ditandai oleh adanya 2 pronukleus dan 2 polar bodi (Gb-13). Zigot tanpa pronukleus atau pronukelus lebih dari 2 adalah tidak normal dan tidak dapat digunakan. Pada saat hendak disuntik zigot di ”pegang” oleh holding pipette. Setelah injection pipette ditusukan ke dalam pronukleus zigot, transgen kemudian dipompakan ke dalam pronukleus (Gb-14).

 
Gambar-11 Holding dan injection pipette serta micromanipulator

Gambar-12 Petri dish injection chamber yang mengandung media kultur dan ditutup

dengan paraffin oil

Masuknya transgen kedalam pronukleus zigot ditandai oleh adanya gelembung kecil (small bubble) dan pembesaran pronukleus. Setelah penyuntikan injection pipette segera ditarik dari zigot dan zigot dilepaskan dari genggaman holding pipette. Satu demi satu zigot kemudian akan disuntikkan dengan transgen. Zigot yang telah disuntik kemudian dikumpulkan didalam 35mm petri dish selama beberapa saat sebelum ditransfer ke dalam saluran telur (oviduct) pseudopregnant mice.

Gambar-13 Zigot yang normal mengandung 2 pronukleus (kiri) dan zigot dalam ”genggaman”

holding pipette, sementara injection pipette tampak dibawah zigot (kanan)

Gambar-14 Proses Penginsersian transgen kedalam pronukleus zigot
  1. Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice (Gb-15)

Organ reproduksi pseudopregnant female mouse dikeluarkan dari tubuh dengan membuat sayatan pada daerah punggung. Fimbrie dan infundibulum saluran telur tikus dikenali. Setelah itu zigot yang telah disuntik dengan transgen ditransfer kedalam infundibulum pseudopregnant mice dengan menggunakan mouth controlled pipette.

Gambar-15 transfer zigot kedalam infundibulum pseudopregnant mice
  1. Zigot yang ditransfer kedalam pseudopregnant mice kemudian akan tumbuh dan berkembang selama 21 hari. Setelah 21 hari ”calon” tikus transgenik ini akan lahir. Anak tikus ini keudian ditunggu hingga besar dan mencapai umur 3 minggu. Setelah itu dilakukan pemeriksaan ada tidaknya transgen yang terintegrasi di dalam genom anak tikus tersebut dengan menggunakan metoda Southern blot (Gb-16)
  1. Ekspresi transgen diperiksa dengan metoda Northern blot (Gb-16).

Tikus transgenik yang berkembang dari zigot tersebut dikenal sebagai ”Founders” dan bersifat hemizygote. Untuk perbanyakan tikus transgenik, founders mice ini kemudian dikawinkan dengan tikus non transgenik. Untuk mendapatkan tikus transgenik yang homozygote, tikus transgenik hemizygote dikawinkan antar sesamanya. Tikus transgenik yang homozygote ini kemudian dipelajari fenotifnya dengan mengamati ada tidaknya kelainan pada organ atau jaringan tertentu selama proses tumbuh kembangnya.

        Gambar-16 Pendeteksian Transgen dan ekspresinya dengan menggunakan motoda

Southern blot dan Northern blot

PENUTUP

            Telah diuraikan tentang pengertian tikus transgenik, penggunaan dan tahap kegiatan yang harus dilakukan untuk membuat tikus transgenik. Pembuatan tikus transgenik memerlukan proses yang panjang dan waktu, biaya serta tenaga yang cukup banyak. Sebagai suatu metoda penelitian invivo tehnik ini sekarang telah banyak digunakan dibanyak tempat di dunia.

Sumber : H. Ahmad Aulia Jusuf, AHK, PhD (Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia)

 

 

 

 

Advertisements

Leave a comment

Filed under Ilmu Penyakit Dalam

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s