PEMERIKSAAN SPERMA PADA KASUS PERSETUBUHAN

PENDAHULUAN

Deteksi dan identifikasi cairan tubuh di TKP adalah aspek yang sangat penting dari ilmu forensik. Cairan tubuh yang paling umum ditemukan di TKP adalah darah, air mani, dan air liur, tetapi lainnya seperti cairan vagina, urin, dan keringat juga dapat memainkan peran penting termasuk kontribusi evidence DNA berharga.

Masalah utama dengan tes-tes ini adalah penghancuran sampel. Kadang-kadang kasus dapat rusak dengan jumlah bukti biologis yang sedikit, sehingga sangat penting bahwa jumlah sampel kecil diperiksa seefisien mungkin dengan metode non destruktif di TKP. Alasan yang paling penting tes non-destruktif ini adalah pelestarian evidence DNS.

Penentuan jenis dan asal cairan tubuh yang ditemukan di TKP dapat memberikan wawasan penting dalam rekonstruksi TKP dengan mendukung hubungan antara donor sampel dan tindak pidana yang sebenarnya. Selama lebih dari satu abad, berbagai jenis metode identifikasi sperma telah dikembangkan, seperti tes kimia, tes imunologi, tes aktivitas katalitik protein, metode spektroskopi dan mikroskop. Namun, metode identifikasi sperma konvensional sebagian besar merupakan test dugaan, dan dilakukan hanya pada suatu waktu. Oleh karena itu, penggunaan pendekatan molekuler genetika berbasis RNA  atau deteksi metilasi DNA baru-baru ini diusulkan untuk menggantikan metode identifikasi cairan sperma konvensional. Beberapa penanda RNA dan tDMRs yang khusus untuk cairan semen yang relevan telah diidentifikasi, dan spesifitas dan sensitivitas telah diuji menggunakan berbagai sampel.

 PEMERIKSAAN SPERMA PADA KASUS PERSETUBUHAN

 Semen merupakan salah satu cairan tubuh yang paling sering ditemui di TKP. Terdapat beberapa tes dugaan serta test konfirmasi untuk mengidentifikasi semen. Berikut ini menjelaskan teknik pemeriksaan yang sudah diakui di bidang forensik atau telah diringkas pada literatur umumnya.

Tanda marker mani telah lama digunakan dalam kasus-kasus kekerasan seksual, namun, dalam sekitar dua pertiga kasus, tidak mungkin untuk mengidentifikasi donor sperma, karena cairan biologis campuran menghasilkan jenis serologis campuran.

Bahkan ketika sperma tidak ada, beberapa jenis sel non-sperma yang ditinggalkan oleh pelaku (epitel, leukosit, sel germinal belum matang) dan merupakan sumber yang layak untuk analisis DNA. Sel-sel ini biasanya ditemukan di sekitar 15% dari bahan sperma yang disediakan oleh kelenjar prostat dan vesikula seminalis. Azoospermia dilaporkan oleh Willott sekitar 1,9% dari bercak air mani yang ditemukan pada swab kasus serangan seksual.

  1. Alternating least squares (ALS)

Mirip dengan darah, air mani juga dapat dideteksi menggunakan alternating least squares (ALS) seperti sinar ultraviolet. Ini merupakan prosedur rutin untuk mencari air mani dan cairan lainnya di TKP menggunakan metode yang sederhana dan  non-destruktif. Wood’s Lamp (WL) adalah perangkat khusus yang memancarkan panjang gelombang 320-400 nm, dengan ukurannya yang kecil, murah, aman, dan mudah digunakan.

Namun ketika WL  diuji terhadap cairan lainnya, alat tersebut menjadi tidak spesifik dan bahkan kadang-kadang tidak mendeteksi noda air mani, dan memberikan hasil positif palsu terhadap salep dan krim. Alat ALS komersial lainnya, BluemaxxTM BM500, diuji dengan cara yang sama dan hasilnya 100% sensitif terhadap noda air mani. Dan juga para dokter yang menggunakan ALS mampu membedakan semen dengan cairan lainnya dengan waktu 83% setelah menerima pelatihan tentang bagaimana menggunakan perangkat tersebut. Perangkat ALS lainnya yang digunakan untuk pemeriksaan cairan termasuk air mani adalah Polilight1 yang memiliki rentang panjang gelombang 415-650 nm cahaya putih ultraviolet.

  1. Seminal acid phosphatase (SAP)

Test pemeriksaan yang paling populer dan diterima keberadaan air mani adalah tes seminal acid phosphatase (SAP). Enzim ini memiliki kemampuan untuk mengkatalisis hidrolisis fosfat organik membentuk produk yang akan bereaksi dengan chromogen garam diazonium yang menyebabkan perubahan warna. Ini merupakan prinsip dasar dari tes SAP. Salah satu kombinasi pengembang substrat / warna populer adalah alpha-naphthyl phosphate dan Brentamine Fast Blue. Kombinasi lain adalah beta-naphthol dengan Fast Garnet B, dan alphanaphthol dengan Fast Red AL. 3

AP (asam fosfatase) adalah enzim yang diproduksi oleh kelenjar prostat. Ini mengkatalisis hidrolisis asam lysophosphatidic, produk pemecahan membran fosfolipid, dan mungkin terlibat dalam kapasitasi spermatozoa (dimana membran sel yang hilang) yang mengekspos protein di kepala akrosom, yang memungkinkan penetrasi ovum. AP ditemukan dalam konsentrasi tinggi dalam air mani (sekitar 1 mg / mL atau 300 U / mL), sehingga berguna sebagai penanda untuk penentuan forensik cairan mani. AP stabil dalam keadaan kering, dan dapat dideteksi dalam bercak air mani lama. Tes  AP  pertama kali dijelaskan oleh Babson pada tahun 1959. Meskipun tidak sensitif seperti tes PSA, namun memberikan hasil yang dramatis dalam waktu 15 detik dengan bercak yang kuat dan sangat mudah digunakan di lapangan.

Gambar 1. Pemeriksaan seminal acid phosphatase (SAP).

Positive bila berwarna ungu dalam 15 detik.

Gambar 2. Alat untuk memeriksa SAP

Reagen tambahan natrium thymolphthalein monofosfat telah digunakan karena selektivitas dan stabilitas yang tinggi dan risiko bahaya rendah, dan merupakan kombinasi pnitroaniline, NaNO3, a-naftil asam fosfat, dan magnesium klorida encer. Tes ini juga menghasilkan hasil positif palsu pada  vaginal acid phosphatase  (VAP), sehingga teknik ini tidak dapat dianggap sebagai test konfirmasi. Salah satu cara untuk menghindari potensi hasil positif palsu pada VAP adalah mengamati perubahan warna yang terjadi antara 5 hingga 30 detik karena VAP tidak pernah memberikan hasil positif yang begitu cepatnya. Metode lain yang telah dikembangkan untuk membedakan antara SAP dan VAP ialah melibatkan pemisahan dua fosfatase asam menggunakan fokus isoelektrik, dan dengan menggunakan elektroforesis gel akrilamida. Kerugian lebih lanjut dari tes SAP adalah enzim dapat menurun ketika terkena panas, jamur, membusuk, atau bahan kimia.

Tabel 1. Komposisi masing masing cairan tubuh

  1. Leucine aminopeptidase (LAP)

Ada tes dugaan serupa untuk pemeriksaan semen berdasarkan adanya enzim lain, tetapi tes ini tidaklah populer. Dalam sebuah studi, perbandingan dengan tes SAP, uji leucine aminopeptidase (LAP) memiliki hasil positif palsu yang lebih sedikit dibandingkan dengan cairan tubuh manusia lainnya dan hanya menunjukkan hasil negatif  dengan spesies lain. Namun tes tersebut kurang sensitif terhadap pengenceran tinggi.

  1. Glycylproline dipeptidyl aminopeptidase (GDA)

Enzim lain yang telah diuji adalah glycylproline dipeptidyl aminopeptidase (GDA). Hasil menunjukkan bahwa noda semen berumur 24 tahun dapat memberikan reaksi positif; positif palsu pada cairan vagina, feses, stroberi, kacang, dan bawang. Sensitivitas diuji dengan pengenceran serendah 1:4 di mana semua hasil positif.

  1. Cystine aminopeptidase (CAP)

Tes berbasis enzim lainnya mendeteksi cystine aminopeptidase (CAP). Enzim ini 100 kali lebih nampak pada air mani dari cairan lainnya. Ketika diuji cairan tubuh lainnya termasuk cairan vagina dan feses, tidak ditemukan adanya hasil positif palsu seperti dengan beberapa tes enzim yang disebutkan sebelumnya.

  1. Gglutamyltransferase (g-GTP)

Sebuah tes dengan enzim gglutamyltransferase (g-GTP) menggunakan garam Fast Garnet GBC dan anaphthylamine sebagai indikator menunjukkan hasil positif pada noda semen tapi dapat memberikan positif palsu pada ASI, cairan vagina, kacang hijau, kacang-kacangan, bawang, stroberi, apel, dan plum.

  1. Pemeriksaan Zinc

Pemeriksaan zinc pada mani telah diteliti dan lebih baik dan kurang degradable dibandingkan SAP. Sebuah metode pemeriksaan paperstrip zinc dibandingkan dengan paperstrip SAP, dan pada akhirnya kedua tes memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang sama. Pemeriksaan ini menggunakan reagen Hooft’s 1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol. Pemeriksaan dianggap positif bila perubahan warna dari kuning ke pink.

Gambar 3. Pemeriksaan Zinc

8. Tes kolin

Tes dugaan pemeriksaan semen lainnya yang telah digunakan sejak lama namun tidak lagi digunakan secara teratur adalah tes kolin. Pemeriksaan kolin menggunakan tes Florence yang menempatkan ekstrak zat yang dicurigai pada slide mikroskop, diberikan larutan yodium dan kalium iodida, dan diamati kristal jarum cokelat yang terbentuk. Kemungkinan negatif palsu sangat besar karena sensitivitasnya rendah, dan tes ini negatif untuk cairan tubuh lainnya seperti cairan vagina serta semen dari spesies lain. Metode pemeriksaan kolin didasarkan pada reaksi dengan kolin oksidase ialah tes chemiluminescent yang melibatkan cairan kolin oksidase / luminol. Sebuah metode yang lebih rumit untuk mendeteksi kolin ialah metode isotachophoresis dimana tidak memiliki positif palsu dengan cairan tubuh lain, buah-buahan, atau sayuran. Bercak berumur 10 tahun masih menunjukkan beberapa hasil positif, dan tes menunjukkan semen positif pada vaginal swab yang diambil dari perempuan yang telah meninggal.

9. Seminal polyamine atau spermine (SPM)

Satu tes dugaan yang telah dipelajari di masa lalu tapi jarang digunakan adalah deteksi seminal polyamine atau spermine (SPM) yang konsentrasinya tertinggi pada air mani. Kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC) dikombinasikan dengan metode ekstraksi sederhana telah ditemukan untuk menjadi cara yang sederhana dan sensitif untuk mendeteksi SPM dibandingkan dengan kromatografi kertas, TLC, tabung kapiler isotachophoresis, dan metode enzim. Positif palsu yang paling umum berasal dari kecap, dan tidak ada spermine diukur dalam cairan tubuh seperti urine, darah, keringat, air susu ibu, dan air liur.

10. Tes Barberio

Test lainnya untuk pemeriksaan spermine yaitu tes Barberio, melibatkan konfirmasi kristal kuning yang terbentuk oleh mikroskop ketika air mani terkena larutan asam pikrat. Tes ini dianggap lebih dapat diandalkan dibandingkan tes Florence untuk kolin, dan masih memberikan hasil positif pada bercak setua 3 tahun dan dipanaskan sampai 150 oC. Sebuah metode yang sama yaitu tes Puanen adalah tes kristal lain yang menggunakan Naphthol Yellow S sebagai reagen dan membentuk kristal oranye dengan adanya air mani.

11. Identifikasi mikroskop

Teknik pemeriksaan konfirmasi yang paling dapat diandalkan dan diterima secara luas untuk mendeteksi air mani adalah identifikasi mikroskopis sel sperma. Semen adalah satu-satunya cairan tubuh yang memiliki sel sperma, dan sejumlah besar DNA di kepala sperma dapat diidentifikasi dengan zat warna untuk membuat sperma terlihat. Zat warna paling populer digunakan adalah zat warna Christmas tree, dikenal warna khas pada kepala sperma adalah merah dan hijau pada ekor.

Teknik tambahan menggunakan larutan proteinase K yang akan mengubah sifat sel-sel epitel dan membuat kepala sperma yang tidak berpengaruh lebih terlihat. Zat warna lain yang kurang efektif daripada zat warna Christmas tree yang telah diuji adalah pewarnaan Gram modifikasi Christmas tree, hematoxylin dan eosin, Baecchi, Papanicolaou, dan Wright. Tentu saja kelemahan terbesar dari teknik mikroskop ini jika donor sperma adalah azoospermia karena penyebab alami atau dengan vasektomi; untuk alasan ini, tes kimia lainnya telah dikembangkan.

Gambar 4. Deteksi spermatozoa berdasarkan pewarnaan Dibandingkan dengan alkaline fuchsin, pewarnaan Christmas tree dan hematoxylin-eosin merupakan metode sitologi baku emas deteksi spermatozoa.

Gambar 5. Analisis mikroskop pada sampel pewarnaan dengan Baechi

12. Prostate-specific antigen (PSA)

Tes konfirmasi yang paling populer untuk sel sperma di luar dari semen adalah tes prostate-specific antigen (PSA).

Antigen spesifik prostat (PSA, juga dikenal sebagai p30), suatu glikoprotein yang diproduksi oleh kelenjar prostat dan disekresikan ke dalam plasma mani, adalah penanda yang digunakan untuk menunjukkan adanya cairan mani.

Air mani dari pria azoospermia masih akan berisi antigen ini yang hadir dalam plasma mani; cairan tubuh lainnya mengandung tingkat PSA yang sangat rendah. Kadar PSA yang rendah mengakibatkan tes PSA tidak terlalu sensitif sehingga tidak dapat mengakibatkan hasil positif palsu. Konsentrasi PSA pada urin laki laki adalah 800 ng/ml. PSA tidak terdeteksi pada urine dilusi laki laki di atas 1/200.7 Sebuah aspek penting untuk pendeteksian PSA melibatkan kemampuan yang baik untuk mendeteksi sampel yang terkontaminasi atau sulit seperti kain yang telah dicuci dan mayat yang membusuk.

Menurut beberapa penelitian, PSA dapat ditemukan dalam cairan tubuh wanita. Breul menyatakan bahwa konsentrasi PSA di urin perempuan rata rata adalah 3,72 ng/ml. Pembentukan protein PSA dipengaruhi oleh steroid; Oleh karena itu, dapat dikembangkan dalam berbagai jaringan tubuh termasuk jaringan perempuan. Walaupun begitu, konsentrasi PSA di urin perempuan sangatlah rendah, sehingga tidak terdeteksi oleh rapid test PSA karena di bawah cut-off point dari perangkat. Dengan demikian, hasil positif palsu yang disebabkan oleh urin perempuan bisa dihilangkan.

Metode yang melibatkan immunoelectrophoresis atau ELISA, dan beberapa teknik khusus immunoassay dot blot dengan metode radiolabeled Protein A serta dot-immunobinding disebut juga membrane aspiration test (MAT). Tes lainnya mengunakan thin-layer immunoassay (TIA) dan tidak menunjukkan hasil positif palsu dengan darah, air liur, urine, keringat, dan air mata. Sekarang telah terdapat beberapa alat tes yang bergantung pada reaksi antigen-antibodi dan jauh lebih cepat dan lebih mudah digunakan.

Pemeriksaan PSA dalam cairan mani kuantitatif relatif sulit dan cukup mahal, sehingga tidak pernah dilakukan di Indonesia. Untungnya, ada rapid test untuk memeriksa PSA, yang sangat praktis, cepat, mudah digunakan, murah, dan cukup sensitif dan spesifik. Namun, rapid test ini dirancang untuk memeriksa konsentrasi PSA dalam darah, plasma, dan serum.

Salah satu alat yang tersedia secara komersial adalah tes Biosign1 PSA, dan alat tersebut lebih murah untuk digunakan daripada metode tradisional ELISA. The OneStep ABAcard1 adalah alat test komersial lainnya. Alat ini juga bergantung pada teknik antibodi mobile monoclonal anti-human PSA yang mengikat PSA manusia dan bermigrasi sepanjang alat strip ke antibodi polyclonal anti-human PSA imobile dan membentuk garis. PSA dalam air mani yang diencerkan 106 kali mampu dideteksi dengan tes ini, dan hanya sampel urin pria memberikan hasil positif palsu.

   Gambar  6.  Pemeriksaan ABAcard (hasil positif dan negative) 

Tes komersial lainnya yang telah dikembangkan meliputi Chembio, Medpro, Onkoscreen, PSAcheck-1,  Seratec1 PSA Semiquant dan Phosphatesmo KM PaperR _ test.5,10 Alat test Seratec1 ditemukan menunjukkan positif palsu dengan sampel cairan vagina bebas semen. Sebuah studi perbandingan antara PSA Rapid Test Kit, Rapid PSA, dan SMITEST menetapkan bahwa tiga alat tersebut memiliki spesifisitas yang sama, tetapi SMITEST memiliki sensitivitas terbesar. Alat tes otomatis yang memungkinkan analisis simultan adalah Hybritech Tandem-E PSA Immunoenzymetric Assay karena menggunakan lebih sedikit tenaga kerja dan dana daripada metode tradisional.

Gambar 7. Pemeriksaan PSA hasil positif dengan Seratec 

MHS-5, yang juga dikenal sebagai immunoglobulin G1 dan seminal vessel specific antigen (SVSA), merupakan antigen yang hanya akan bereaksi dengan epitel di vesikula seminalis manusia. Protein utama pembentuk gel dalam air mani manusia, semenogelin I dan semenogelin II, keduanya mengandung SVSA dan dapat dideteksi oleh antibody MHS-5  monoklonal. Sema1 adalah alat tes ELISA yang dirancang untuk mendeteksi keberadaan semen berdasarkan reaksi antara antibody MHS-5 dan SVSA. Metode ini sensitif untuk sampel semen yang diencerkan sebanyak 106 kali, tapi tidak sama spesifik dengan tes PSA  dan tidak lagi digunakan. Metode imunologi lain yang telah dikembangkan untuk mendeteksi air mani melibatka semenogelin, semenogelin II, 19-OH F1A / F2a prostaglandin, dan antibodi monoklonal yang disebut 1E5. Akhirnya, teknik ELISA untuk mendeteksi antibodi monoklonal untuk SAP telah dikembangkan yang tidak menunjukkan hasil positif palsu dengan cairan tubuh lainnya dan sensitif dengan pengenceran air mani hingga 1: 100.000.

13. Isozim LDH dan Isozim lainya

Seperti disebutkan sebelumnya dalam diskusi tentang mengkonfirmasikan adanya darah, suatu isozim LDH juga dapat berperan dalam mengkonfirmasikan kehadiran air mani. LDH isozym memiliki properti di antara LDH-3 dan LDH-4 dan dinamakan LDH-X. Hal ini unik terhadap sperma manusia, bagaimanapun, teknik pewarnaan Christmas tree, metode LDH hanya akan bekerja jika air mani donor mengandung sperma. Isozim terdeteksi dengan elektroforesis, dan teknik ini akan memberikan hasil positif pada pewarnaan setidaknya setelah 30 minggu dan pada swab vagina pasca-coital. Sperma bahkan dapat dideteksi dalam campuran dengan darah dan cairan vagina menggunakan metode ini. Metode ini tidak umum digunakan di laboratorium forensik modern.

Isozim lain yang dapat digunakan untuk mendeteksi air mani adalah g-glutamil transpeptidase (GGT). Isozym ini jauh lebih aktif dalam plasma mani dari cairan tubuh lain.. Beberapa isozim lainnya telah dipelajari seperti ” sperm” diaphorase, creatine phosphokinase (CPK), dan berbagai esterase, tetapi metode ini belum terbukti sama efektifnya dengan tes PSA yang lebih populer.

Tabel 2.  Ringkasan Pemeriksaan Sperma Model Lama 

                                  Tabel 3.  Ringkasan Pemeriksaan Sperma Model Baru

14. SPERM HY-LITER

SPERMA HY-LITER TM dikembangkan dan divalidasi untuk analisis mikroskopik spermatozoa manusia dari bukti serangan seksual. Kekhasan metode ini dilakukan dengan fluorescent antibodi monoklonal Alexa 488 (flourescein isotiosianat hijau – FITC), yang secara khusus menargetkan antigen pada membran inti sel sperma. Dalam hubungannya dengan Alexa 488, perwarnaan inti biru, 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), juga dimasukkan sebagai bagian dari pewarnaan tersebut. Akibatnya, semua sel yang mengandung inti kaya DNA dapat divisualisasikan melalui penggunaan selektif DAPI kompatibel penyaring fluoresent.

Hal ini memungkinkan untuk memvisualisasikan berbagai sel tanpa perlu degradasi selektif epitel / sel vagina oleh proteinase K sebelum analisis mikroskopis. Karena fluoresensi intens, sedikitnya satu sel sperma dapat diidentifikasi antara sampel padat sel epitel vagina yang sering ditemukan pada swab serangan seksual. 

Gambar 8. Sampel analisis mikroskopik SPERM  HY-LITER.

Percobaan dilakukan menunjukkan bahwa uji Sperma Hy-LiterTM adalah (1) sangat spesifik dan valid (tidak ada gangguan dari semen diperoleh dari berbagai hewan dan tidak adanya sinyal fluoresensi positif di semua slide control dari swab darah, ragi, urin, epitel vagina sel atau feces), (2) sensitif dan dapat diandalkan (spermatozoa terdeteksi pada swab vagina dilarutkan dalam pengenceran semen 1: 1000 dan 1: 10.000; spermatozoa terdeteksi lebih efektif dalam sampel mengandung beberapa spermatozoa dibandingkan menggunakan mikroskop), (3 ) cepat (1 menit dibandingkan rata-rata 10 menit atau lebih menggunakan mikroskop untuk spermatozoa < 10), (4) kuat (spermatozoa dideteksi pada noda semen berusia 24 tahun, bebas dari spermisida, pelumas, kondom fluorescent dan non-fluorescent dan krim anti-jamur) dan (5) sederhana untuk digunakan.

15. Skoring Sperma

Metode yang paling banyak digunakan untuk mengklasifikasikan kehadiran spermatozoa dengan visualisasi dikembangkan pada tahun 1974 oleh Davies dan Wilson. Metode menggunakan serangkaian plus (+) untuk merekam jumlah spermatozoa yang diamati. Sebutan digunakan adalah:

++++,  banyak  spermatozoa  di setiap lapang pandang;

+++,  banyak atau beberapa spermatozoa  di seluruh lapang pandang;

++,  beberapa spermatozoa  di beberapa lapang pandang,  mudah untuk digunakan;

+,  sulit untuk ditemukan,  dan;

0,  tidak nampak spermatozoa.

Metode  skoring sperma saat ini sangat subjektif dengan % RSD slide sangat tinggi dengan jumlah sperma rendah secara keseluruhan. Selain itu, rekaman ekor tidak menambah nilai teknik skoring sperma. Penelitian lebih lanjut mungkin meningkatkan objektivitas penilaian sperma dan keandalan pencatatan ekor sperma.

16. Sperm-elution

Secara historis, metode yang paling umum untuk menghilangkan sel-sel dari sampel dikirimkan untuk dilakukan pemeriksaan elusi air. Ketika  sel merupakan campuran, biasanya epitel dan spermatozoa, slide elusi dan sentrifugasi disiapkan dan jika spermatozoa ditemukan, ekstraksi preferensial ini dapat dilakukan sebelum profiling DNA.

Ekstraksi preferensial memisahkan fraksi spermatozoa dan sel epitel, paling sering memproduksi dua profil DNA; satu terutama dari bahan epitel dan lainnya dari laki-laki (spermatozoa).

Proses ini bukan tanpa keterbatasan. Menurut AFSP Body Fluid Forum (BFF) menunjukkan bahwa pemulihan awal spermatozoa dalam sel pelet yang dihasilkan oleh metode ekstraksi air adalah 20%. Penilaian jumlah pulih spermatozoa pada slide mikroskop dapat terhambat oleh kehadiran sel-sel epitel berinti (NECs) yang dapat menyembunyikan spermatozoa sehingga sulit untuk ditemukan. Jika pemulihan spermatozoa rendah dan pemisahan fraksi mani dan epitel sulit, kemungkinan menghasilkan profil DNA mani yang dilaporkan sangatlah kecil.

Orchid Cellmark (Cellmark) telah mengembangkan protokol elusi dua tahap; Sperma Elusi©. Metode ini memungkinkan pelepasan NECs utuh dan beberapa spermatozoa terutama pada fase pertama dan fase kedua. Pelet mani terdiri dari NECs utuh jumlah terbatas dan sel debris kecil, menghasilkan slide yang lebih mudah mencari rendahnya spermatozoa juga  menghasilkan fraksi mani  mengandung DNA epitel. 

  1. Slide dari sampel elusi air Cellmark ( pembesaran ×400 ).
  2. Slide dari elusi sperma ( pembesaran ×400).

Gambar 9. Persentase rata rata recovery dari swab polyester Scenesafe® ketika spermatozoa dalam jumlah ‘tinggi’  (sekitar 4700) dan jumlah ‘rendah’ (sekitar 470)  (n = 10 swab per metode elusi).

  1. Metode RT-PCR

Bagian berikut akan menjelaskan teknik-teknik baru dalam unit forensik yang mendeteksi semen. Seperti dengan darah, kebanyakan tehnik ini melibatkan penanda imunologis dan sekaligus dapat mengidentifikasi spesies dari sampel air mani yang tidak diketahui.

Banyak metode baru yang dikembangkan untuk mengidentifikasi semen dengan melibatkan penanda mRNA dan metode yang sama  telah disebutkan untuk mendeteksi noda darah. Ulasan Bauer mengenai penggunaan RNA dalam ilmu forensik juga mencakup metode pendeteksi air mani. Metode ko-isolasi RNA dan DNA yang dijelaskan oleh Alvarez et al. juga dapat diterapkan untuk sampel air mani. Protamine 1 (PRM1) adalah penanda semen khusus yang masih diselidiki dalam penelitian ini.

Metode RT-PCR yang diusulkan oleh Juusola dan Ballantyne pada tahun 2005 juga dapat digunakan untuk memeriksa semen. Proses ini melibatkan deteksi gen spesifik air mani-PRM1 dan protamin 2 (PRM2). Metode paten mulai dikembangkan untuk teknik yang sama. Sensitivitas untuk sampel air mani adalah yang tertinggi di antara cairan tubuh lainnya yang terdeteksi dengan kurang dari 200 pg RNA yang diperlukan untuk hasil yang positif untuk kedua gen. Spesivitas terbukti saat gen ini hanya terdeteksi dalam sampel air mani.

Metode RT-PCR octaplex tidak menghasilkan positif palsu, tidak ada negatif palsu, dan tidak ada gen tunggal drop out. Versi terbaru percobaan ini disajikan pada tahun 2007 melibatkan sistem tripleks, dan gen yang terlibat yaitu gen semen PRM1 dan PRM2 bersama dengan gen GAPDH. Sebuah studi serupa dilakukan pada tahun 2008 dengan menggunakan gen semen yang sama PRM1 dan PRM2 dimana dilakukan oleh Juusola dan Ballantyne, dan ditemukan bahwa hasil positif pada semen yang berusia hingga 15 bulan. 

Pendekatan RT-PCR yang dikembangkan oleh Nussbaumer et al. pada tahun 2006 berfokus pada kallikrein 3 (KLK) penanda untuk semen (juga dikenal sebagai PSA). Tidak ada reaktivitas silang dengan sampel dari cairan lain seperti darah, cairan vagina, dan air liur, dan tidak ada dari sampel ini menunjukkan hasil positif untuk uji KLK. Juga, penanda semen mRNA khusus  ini menunjukkan stabilitas yang besar dan sama-sama terdeteksi setelah 10 hari penyimpanan pada suhu kamar tanpa adanya buffer stabil. Teknik ini terbukti lebih sensitif dibandingkan tes berbasis protein PSA.

18. Rapid stain identification (RSID)Semen Test

Pada tahun 2007 Pang dan Cheung membandingkan rapid stain identification  (RSID) -Semen Test dengan tes ABAcard1 PSA untuk deteksi bercak air mani.

RSID-Semen Test didasarkan pada deteksi semenogelin (Sg) menggunakan antibodi monoklonal anti-human Sg. Kedua tes melibatkan teknologi immunochromatographic membrane assay. RSID-Semen Test ditemukan lebih sensitif mendeteksi Sg pada pengenceran semen 1: 100.000. Test air mani pada beberapa spesies yang berbeda  yang dinyatakan positif spermatozoa semua menunjukkan hasil Sg negatif. Tes ini tidak menunjukkan positif palsu dengan cairan tubuh lainnya, dan analisis hanya memakan waktu 10 menit. Alat test komersial lain yang mendeteksi Sg disebut Nanotrap Sg. Alat ini memiliki sensitivitas yang sama dengan RSID-Semen Test, tetapi lebih dari tiga pengulangan pembekuan dan pencairan sampel semen menyebabkan hasil sensitivitas menurun. Tes ini dapat mendeteksi semen pada  67% sampel yang tidak mengandung spermatozoa. 

Kemampuan metode ini untuk menemukan DNA pada sampel yang tidak menunjukkan spermatozoa membuatnya berharga untuk dilakukan analisis DNA selanjutnya.

Gambar 10. Pakaian putih dan hitam mengandung semen diiluminasi dengan Lumatec Superlight 400 at 550 nm. Alat ini mengunakan gelombang 320 – 700 nm. 

Mirip darah, Trombka et al. telah memperkenalkan metode identifikasi semen non destruktif. Metode melibatkan teknologi NASA yang unik,  melibatkan XRF portabel yang dapat mendeteksi zat Seng dalam bercak air mani, dan juga memiliki potensi untuk menjadi bantuan berharga dalam identifikasi semen di TKP karena perangkatnya yang portabel. Proses ini hanya membutuhkan waktu sekitar satu menit, dan memiliki presisi baik lebih dari 10% dalam mengukur 1 ml air mani dalam area 40 cm2. Metode  non-destruktif akan sangat membantu dalam kasus-kasus kekerasan seksual yang mengandalkan bukti DNA yang tidak hancur akibat tes skrining awal. 

19. Lumatec Superlight 400

Akhirnya, tes terbaru dikembangkan untuk pemeriksaan bercak air mani adalah sumber cahaya UV-vis disebut Lumatec Superlight 400. Alat tesebut memancarkan cahaya 320-700 nm dan dilakukan uji pada sampel air mani manusia dan babi  pada jenis dan warna kain yang berbeda. Gambar. 10 menunjukkan hasil bercak bercahaya pada kain terang dan gelap dengan filter yang berbeda. Superlight mampu mendeteksi bercak baik di kegelapan dan di siang hari; waktu penyimpanan 3 dan 5 minggu tidak menunjukkan perbedaan dalam hasil. Semen paling baik dideteksi menggunakan cahaya kisaran 415-490 nm dengan kacamata oranye atau merah. Hasil buruk diperoleh pada kain gelap dan pada kain yang telah dicuci, tetapi berbagai jenis kain menunjukkan hasil yang sama.

                      Gambar 11. Lumatec Superlight 40

20. Metode non destruktif

Tabel 2 menunjukkan bahwa banyak metode identifikasi cairan tubuh menggunakan tes kimia yang bersifat destruktif untuk mengidentifikasi komponen-komponen tertentu di setiap cairan. Melihat Tabel 3, jelas bahwa banyak teknik yang muncul menggunakan metode mRNA yang sangat spesifik. Kecuali profil DNA secara bersamaan dianalisis seperti yang diusulkan oleh Alvarez et al., bahan sampel tambahan akan diperlukan untuk melakukan tes DNA kedua. Seperti disebutkan sebelumnya, kemampuan untuk mengidentifikasi cairan tubuh di TKP dengan cara non-destruktif sangat penting untuk melestarikan sampel dan bukti DNA. Selain menjadi tak rusak, tes yang bisa dilakukan di TKP akibat dari pemeriksaan terbatas di laboratorium sangat penting dilakukan karena memberikan jawaban instan. 

Hal ini memberikan informasi berharga pada para peneliti tentang bercak yang sulit diketahui seketika sehingga mereka dapat mengubah penyelidikan mereka. Ada beberapa metode non destruktif yang telah disebutkan, namun terdapat dua metode yang memiliki kemampuan terbaik untuk mengkonfirmasi setiap cairan. Kedua metode baru tersebut melibatkan spektroskopi fluoresensi dan spektroskopi Raman, dimana masih dalam tahap percobaan pengembangan dan saat ini tidak sedang digunakan untuk pengujian forensik.

Harapannya adalah bahwa teknik ini pada akhirnya akan diterima oleh komunitas forensik dan akan dapat memberikan konfirmasi, identifikasi non-destruktif dari cairan tubuh di TKP tanpa perlu pengujian laboratorium yang panjang. Mungkin ada kebutuhan untuk duplikat pengujian di laboratorium dalam tahap awal penerapan metode ini untuk menunjukkan hasil yang handal dan cocok untuk kesaksian pengadilan, tetapi akhirnya metode baru harus mampu menghasilkan hasil yang dapat diterima, cara kerja otomatis dan sederhana untuk digunakan oleh penyidik dan polisi di TKP. 

20.1. Fluorescence spectroscopy

Spektroskopi fluoresensi adalah teknik sensitif yang menggunakan fluorophore,  merupakan kelompok kimia suatu analit yang menyerap radiasi (biasanya di daerah ultraviolet) dan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang spesifik. Teknik ini tidak menggunakan reagen perusak dan tidak menyebabkan kontak dengan sampel, tetapi sifat non-destruktif dipertanyakan karena kemungkinan adanya fotodegradasi setelah terpapar sinar ultraviolet.

Sebuah metode mendeteksi air liur menggunakan spektroskopi fluoresensi telah dibahas sebelumnya. Selain itu, Powers dan Lloyd menunjukkan bahwa spektroskopi fluoresensi ultraviolet dapat diterapkan untuk mengidentifikasi beberapa cairan tubuh. Kemampuan setiap tes yang akan diterapkan ke beberapa cairan merupakan karakteristik berharga karena menghilangkan dugaan mengenai tes apa yang akan digunakan berdasarkan cairan apa yang mungkin tidak diketahui. Banyak komponen yang ditemukan dalam cairan tubuh dapat menunjukkan fluoresensi seperti asam nukleat, protein dan lipid, produk metabolit dalam urin, heme dalam darah, air mani kering. 

Komposisi cairan masing masing individu (lihat Tabel 1) adalah unik, dan sidik jari kimia akan sesuai dengan karakteristik spektrum emisi. Gambar.12 menunjukkan spektrum emisi dari semen, darah, air liur, dan urin diukur dengan panjang gelombang eksitasi 260 nm. Eksitasi panjang gelombang terendah yang digunakan adalah 260 nm, dan tidak jelas apakah panjang gelombang ini akan merusak bukti DNA mirip dengan kerusakan yang diamati dalam penelitian lain menggunakan eksitasi 255 nm. Teknik ini sangat ideal karena dapat dengan cepat memindai area bahan bernoda yang luas dan sangat sensitif. Penggunaan beberapa panjang gelombang eksitasi dan deteksi fluoresensi atas berbagai panjang gelombang memungkinkan untuk identifikasi cairan tubuh tertentu tanpa tumpang tindih karakteristik masing masing.

Gambar 12. Spektrum fluoresensi emisi semen  (—), skin oil (-..-..), blood (- – -), saliva (-.-.), and urine (———)260 nm.

Studi independen lain memperkenalkan alat fluoresensi genggam yang berpotensi dapat digunakan di TKP untuk memberikan umpan balik instan tentang identitas cairan tubuh. Alat ini dirancang pada tahun 2003 untuk mendeteksi mikroba contamina tion, tetapi sensitivitas tinggi akan membuatnya ideal untuk aplikasi deteksi cairan tubuh ketika digabungkan dengan perangkat lunak yang tepat.

20.2. Raman spectroscopy

Spektroskopi Raman merupakan teknik bioanalitis non-destruktif lainnya yang memiliki potensi besar identifikasi konfirmasi cairan tubuh di TKP. Spektroskopi Raman, bila dibandingkan dengan spektroskopi fluoresensi, menunjukkan selektivitas dan spesifitas kimia dan biokimia yang lebih tinggi walaupun memiliki sensitivitas yang lebih rendah, dan berpotensi digunakan dalam menyelesaikan sampel campuran beberapa cairan tubuh. Teori di balik spektroskopi Raman didasarkan pada hamburan inelastis sinar laser intensitas rendah, non-destruktif oleh sampel padat, cair atau gas.

Sangat sedikit atau tidak ada persiapan sampel yang dibutuhkan, dan jumlah bahan uji yang diperlukan oleh mikroskop Raman sebanyak picograms atau femtoliter. Spektrum Raman terdiri dari beberapa band yang sempit dan memberikan  getaran unik. Tidak seperti spektroskopi absorpsi IR, jenis lain dari spektroskopi vibrasi, spektroskopi Raman menunjukkan sedikit gangguan air, yang membuatnya menjadi teknik  analisis cairan tubuh yang hebat. Biasanya, spektroskopi Raman non resonansi tidak merusak sampel.

Bercak atau swab dapat diuji di lapangan dan masih dapat digunakan lebih lanjut di laboratorium untuk analisis DNA, dan yang sangat penting untuk aplikasi forensik. Desain spektrometer Raman portabel adalah realitas kemampuan untuk membuat identifikasi di lapangan. Gambar.13 menunjukkan foto instrumen Raman portabel yang dirancang untuk mengidentifikasi narkotika, bahan peledak, bubuk putih, senjata kimia, dan industri kimia yang ditemukan di TKP. Sekali lagi, dengan software yang tepat dan implementasi database, perangkat portabel ini berpotensi dapat digunakan untuk mendeteksi cairan tubuh di lapangan.

Gambar 13. Spektometer Raman portabel

Microspectroscopy Raman memanfaatkan cahaya inframerah pendek non-actinic (non-destruktif) untuk eksitasi, baru-baru ini diterapkan untuk analisis cairan tubuh yang mengering termasuk darah, air mani, air liur, cairan vagina, dan keringat. Hasil yang dilaporkan sangat menjanjikan dan menunjukkan spektrum Raman mengidentifikasikan setiap cairan tubuh yang berbeda. Komposisi yang berbeda dari masing-masing cairan yang tercantum dalam Tabel 1 membuat setiap cairan itu unik, dan variasi ini menghasilkan karakteristik spektrum Raman.

Sifat spektrum Raman memiliki puncak tajam yang berbeda dengan luas puncak spektrum emisi fluoresensi membuat metode spektroskopi Raman jauh lebih selektif dan spesifik, dan teknik ini berpotensi lebih berguna untuk tujuan forensik. Pekerjaan masa depan berupa  mengevaluasi potensi spektroskopi Raman sangat diperlukan untuk menganalisa campuran cairan tubuh serta bercak pada berbagai substrat. Potensialnya campuran dari beberapa cairan tubuh dapat dikarakteristikan dengan spektroskopi Raman menggunakan analisis statistik canggih seperti significant factor analisis (SFA) dan alternating least squares (ALS) menggunakan perangkat lunak seperti MATLAB 7.0.

Spektrum Raman cairan tubuh setiap individu memiliki puncak sesuai dengan komponen biologis tertentu, dan campuran cairan akan menghasilkan spektrum yang merupakan kombinasi dari semua puncak ini yang dapat diselesaikan secara matematis menjadi spektrum secara individual. Selain itu, spektroskopi Raman mampu membedakan antara semen manusia dan anjing. Kemampuan untuk membedakan jenis cairan tubuh di TKP juga sangat penting, dan beberapa teknik yang disebutkan sebelumnya dapat melakukan tugas ini hanya dengan cara destruktif. Studi lain tidak dapat membedakan kucing, anjing, dan sampel darah manusia menggunakan spektroskopi Raman. Penelitian lebih banyak diperlukan untuk menentukan kemampuan metode ini untuk mengidentifikasi spesies yang berbeda.

Gambar 14.Spektrum Raman pada mani, cairan vagina, air liur, keringat, dan darah dengan eksitasi 785-nm

20.3 Kombinasi fluorescence in situ hybridisation dan laser microdissection

Murray et al. menjelaskan menggabungkan fluoresensi in situ hibridisasi (FISH) dan laser microdissection  (LMD) untuk mengidentifikasi dan mengisolasi sel laki-laki dari campuran sel laki-laki dan perempuan. Sampel  intim harus diperoleh  beberapa jam setelah hubungan seksual. Penerapan teknik ini terbatas pada sejumlah kecil kasus dengan persyaratan sampel yang akan diambil dalam waktu 24 jam dari kejadian. Teknik ini juga bergantung pada sampel kualitas yang baik dan sel utuh; Oleh karena itu, penting bahwa sel tidak mengalami lisis.

FISH / LMD memerlukan penggunaan 34 siklus PCR; Namun, kajian independen menegaskan bahwa teknik LCN DNA yang digunakan oleh FSS adalah bentuk bukti divalidasi  dan cocok untuk tujuan.

Gambar 15. Sel wanita dan pria dengan pewarnaan fluorescence in situ hybridisation. Chromosom X (orange) dan chromosom Y (hijau) diwarnai dengan alat Vysis CEP1X Spectrum OrangeTM/Y Spectrum GreenTM DNA. 

21. Pemeriksaan DNA

Sampel dari kasus serangan-seksual sering ditandai dengan campuran seimbang dari sel epitel dan sperma, dengan campuran cairan tubuh korban, yang mengakibatkan rasio yang tidak menguntungkan DNA laki laki : perempuan. Menurut beberapa penelitian, komponen DNA autosomal laki-laki dari campuran terlalu rendah untuk dideteksi di atas rasio laki-laki : DNA perempuan 1 : 10 – 1 : 20. Pada dasarnya adalah karena kompetisi primer selama amplifikasi PCR, yang mengarah ke amplifikasi preferensial komponen utama dari campuran. Dalam kasus tersebut, penggunaan penanda genetik Ychromosome, seperti short tandem repeats (STR), memungkinkan amplifikasi jumlah rendah dari DNA laki-laki yang bebas dari  DNA korban. Namun, profil Y-STR tidak informatif sebagai profil STR autosom. Pertama, hubungan paternal pada laki-laki tidak dapat dibedakan. Kedua, frekuensi profil Y-STR di populatio bisa relatif tinggi, menghambat diskriminasi beberapa laki-laki yang tidak terkait. Ketiga, profil Y-STR tidak masuk dalam database DNA nasional. Oleh karena itu, profil Y-STR yang diperoleh secara umum hanya dapat dibandingkan dengan profil Y-STR dari suspek yang dikenal.

Oleh karena itu, laboratorium forensik-genetika mencoba untuk memisahkan cairan laki-laki dari cairan wanita untuk meningkatkan peluang mendapatkan profil autosomal pelaku. Beberapa teknik pemisahan sel yaitu: lisis diferensial, yang bergantung pada ketahanan diferensial spermatozoa dan sel epitel terhadap bahan kimia; laser microdissection, yang memungkinkan eksisi dan koleksi spermatozoa, tidak bergantung dari bahan selular sekitarnya; membran filtrasi dan pelatan mikro yang mengeksploitasi perbedaan antara ukuran dan bentuk sel-sel; dan aliran cytometry, yang mengambil keuntungan dari protein membran tertentu untuk menandai dan memisahkan sel. Kebanyakan laboratorium forensik menggunakan ekstraksi DNA diferensial, yang tidak memerlukan peralatan yang mahal dan cepat dicapai. Secara singkat, teknik ini termasuk langkah lisis sel ringan yang memungkinkan pemulihan fraksi sel-epitel diperkaya dengan DNA sel-sel epitel wanita dan leukosit. Lisis sel yang kuat kemudian digunakan untuk memecahkan membran spermatozoa dan memulihkan fraksi DNA sperma.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

Leave a comment

Filed under tropikal infeksi

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s